類別說明
宮頸癌是嚴重威脅女性健康的婦科腫瘤之一。目前，人乳頭瘤病毒（HPV）被認為是宮頸癌的主要病因。然而，HPV 感染大多數是短暫的，只有一部分持續感染的女性最終會患上宮頸癌。因此，可能還有其他因素促進了 HPV 的持續感染，從而提高了宮頸癌發生的風險[1]。?
大量流行病學調查顯示慢性沙眼衣原體感染是高危型HPV持續感染導致宮頸癌的協同因素。衣原體感染使高危型HPV持續感染的風險增加，繼而使宮頸癌風險增加，但沙眼衣原體感染可增強HPV相關的致宮頸癌作用機制尚未完全闡明[2]。
近期Nature Communications 期刊上發表了一篇名為Modelling Chlamydia and HPV co-infection in patient-derived ectocervix organoids reveals distinct cellular reprogramming的論文，該論文闡明了HPV 和沙眼衣原體（C. trachomatis）共感染誘導的獨特轉錄和翻譯后導致宿主細胞重編程的機制，二者從相反的方向影響細胞和基因組穩定性，從而促進腫瘤的形成，揭示了宮頸癌的發生發展機制[3]。
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外宮頸類器官模型的構建-印證了E6/E7開啟致癌路徑
研究者從健康志愿者上分離出宮頸外干細胞，將其嵌入基質膠中培養 3D 類器官，并檢測不同型別HPV 的 E6/E7 基因。研究HPV 整合對健康供體的 HPV E6/E7 陰性的類器官（hCEcto）的影響。同時，研究者用攜帶 HPV16 E6/E7 癌基因的慢病毒轉染 hCEcto上皮干細胞，將E6/E7 整合到宿主細胞基因組中，構建出能模擬HPV感染特性的類器官（hCEcto E6/E7）。結果發現，HPV16 E6/E7 整合到外宮頸類器官中會誘導一種具有子宮頸上皮不典型增生（CIN，被認為是癌前病變）特征的表型。這說明，遺傳改造后的類器官能模擬宮頸HPV感染，為研究HPV的作用機制開辟新途徑。
此外，研究者通過qRT-PCR分析，評估了轉導的hCEcto類器官細胞中HPV E6/E7的相對表達水平，并將其與W12細胞系相比較[W12細胞系來源于一名患有低度宮頸病變的患者，該患者宮頸病變的原代角質細胞中含有處于游離狀態（W12-epi）的HPV、HPV E6/E7整合（W12-int）基因組和含有外體HPV16基因組（KC-epi）]。結果顯示，E6/E7在hCEcto E6/E7類細胞和W12-int細胞中的表達水平高于W12-epi和KC-epi細胞；hCEcto E6/E7類細胞中E6/E7的表達稍高于W12-int細胞。單分子RNA原位雜交（smRNA-ISH）分析證實E7基因在hCEcto E6/E7細胞中的強表達。而未檢測到病毒粒子組裝所必需的晚期基因L1的信號。相比之下，KC-epi細胞生成的類器官在管腔細胞中表達E7和L1基因，表明類器官模型支持HPV的生產生命周期（圖1）。
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圖1?HPV陰性外宮頸類器官整合HPV16 E6/E7癌基因的遺傳操作
HPV16 E6/E7 的表達影響沙眼衣原體的生命周期變化
同時研究者也在外宮頸類器官中建立了沙眼衣原體感染方案以研究沙眼衣原體和 HPV 共感染對宮頸的影響及相互作用。沙眼衣原體具有雙相生命周期：在細胞外是孢子樣具高度傳染性的細胞，稱為原體（EB）；進入細胞后，轉化為無侵染性、可復制的細胞，稱為始體（RB）。研究發現當用沙眼衣原體去感染類器官，在有無HPV E6/E7基因的模型中均能看到兩種形態（原體和始體）的沙眼衣原體，并且能檢測到沙眼衣原體在不斷增殖。在高清透射電子顯微鏡下，還可以觀測到沙眼衣原體存在另外兩種形態（圖2）：中間體和異常體。通過計數統計發現，在有無HPV E6/E7基因的模型中沙眼衣原體的形態有明顯差異：在HPV E6/E7模型中原體顯著減少，并且始體和異常體顯著增加。這表明，HPV E6/E7基因增加了異常體的形成，影響了沙眼衣原體的生命周期變化。
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沙眼衣原體的共感染能抑制HPV E6/E7引起的宿主基因轉錄水平變化
研究者對不同條件下的細胞進行轉錄組分析，以確定沙眼衣原體、HPV E6/E7 單一感染和合并感染對細胞信號傳導的影響。發現HPV E6/E7和沙眼衣原體能以不同的方式上調或下調宿主基因轉錄水平，引起細胞產生與CIN類似的轉錄譜。令人驚訝的是，沙眼衣原體的共感染能抑制HPV E6/E7引起的宿主基因轉錄水平變化。在被HPV E6/E7影響的基因轉錄本中，28%的基因轉錄本表達量的改變能被沙眼衣原體抑制。最顯著的是E2F轉錄因子家族：HPV E6/E7顯著上調E2F的表達水平，但沙眼衣原體感染后抑制E2F轉錄。目前尚不清楚這種沙眼衣原體介導的對 HPV E6/E7 誘導的 E2F 靶標的抑制將對宿主細胞和病原體產生什么影響（圖3）。
研究人員用沙眼衣原體感染了 hCEcto 類器官和 hCEcto E6/E7 類器官，用于研究沙眼衣原體和HPV E6/E7對 Rb-E2F1 途徑的調節作用，進行了qRT-PCR 和免疫印跡分析。結果顯示，在沒有 HPV E6/E7 表達的情況下，沙眼衣原體顯著抑制 E2F1 和腫瘤抑制因子 p53（TP53），而共感染導致TP53明顯減少，但是E2F1和RB1轉錄本沒有顯著減少。與沙眼衣原體感染相反，HPV E6/E7上調 TP53、E2F1 和 RB1 基因表達。無論是否感染 HPV，沙眼衣原體感染 hCEcto 細胞后，總Rb、pRb（S807/811）、E2F1 和 p53 蛋白減少。然而，E6/E7 表達增加 E2F1 蛋白水平并誘導 p53 幾乎完全降解，而對總 Rb、pRb(S807/811) 蛋白水平沒有顯著影響。結果表明，HPV會誘導 E2F1 激活，而衣原體則對其發揮抑制作用。感染 HPV后，p53在轉錄水平上上調，而在感染衣原體后下調。HPV 和衣原體共同感染導致 p53 蛋白降解。
隨后，研究者通過在未感染、感染沙眼衣原體、表達 E6/E7 和共感染的 hCEcto 細胞之間進行基因集富集分析（GSEA）分析，評估受差異表達基因（DEG）影響的生物學功能。結果發現，HPV E6/E7 和沙眼衣原體均強烈上調腫瘤壞死因子（TNF）通路，以及與干性相關的基因，并下調分化相關基因。
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圖3沙眼衣原體、HPV16?E6/E7和共感染誘導的宿主轉錄反應
基因調控通路研究發現，沙眼衣原體感染會抑制E2F1轉錄，其調控的目標基因涉及堿基錯配修復（MMR）。研究者采用了蛋白酶抑制劑 MG-132 和 Lactacystin 來抑制細胞和衣原體蛋白酶 CPAF32，使用 Nutlin-3a 抑制 MDM2 和 p53 之間相互作用，以檢測 p53 穩定對 MMR 基因表達和蛋白水平的影響。結果表明，Nutlin-3a 和 MG-132 處理恢復了沙眼衣原體感染后的 MMR 基因表達，并可以抑制沙眼衣原體誘導的 p53 降解，而 E2F1 的降解在所有處理條件下均降低。
為了進一步研究沙眼衣原體如何調節 HPV E6/E7 共感染中的 MMR 途徑，在有或沒有沙眼衣原體感染的情況下，用 Nutlin-3a、MG-132 和 Lactacystin 處理 hCEcto E6/E7 干細胞。結果顯示，沙眼衣原體的感染性在所有處理條件下都降低了。以上結果表明，蛋白酶體降解是一種重要機制，可明顯調節 E2F 介導的 MMR 基因轉錄并減少共感染中的 p53、E2F 和 MMR 蛋白。進一步研究還發現，沙眼衣原體感染會下調腫瘤抑制因子p53（TP53）基因的轉錄和p53蛋白的表達。綜上，在宿主細胞加速增生的背景下，沙眼衣原體引發DNA損傷，以及對堿基錯配修復通路的抑制，提升了宿主基因組突變活力（圖4）。
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圖4模型描述了HPV E6/E7和衣原體感染對MMR的機制調節
研究者通過引入一種宮頸類器官模型，以研究表皮組織和病原體之間復雜的相互作用和發病機制，以及 HPV16 E6/E7 和衣原體的個體和共感染宮頸組織的相互作用。系統地揭示了 HPV16 E6/E7 和沙眼衣原體對宿主細胞的影響，展示了多重或連續感染帶來的危害以及導致致癌的分子機制，也再次證實了E6/E7的表達在宮頸癌發生發展中的重要作用。
參考文獻：
[1]趙敬, 楊金豪, 張文帆,等. 2009-2020年中國女性生殖道支原體,衣原體和人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌發生相關性的Meta分析[J]. 天津醫科大學學報, 2021, 27(4):5.
[2]呂盈盈, 吳奇, 王麗,等. 沙眼衣原體增強HPV持續感染免疫機制的研究[J]. 中國初級衛生保健, 2018, 32(3):3.
[3]Koster, S., et al., Modelling Chlamydia and HPV co-infection in patient-derived ectocervix organoids reveals distinct cellular reprogramming. Nature Communications, 2022. 13(1): p. 1030.